雙抗夾心ELISA法是指講特異性針對代測抗原的抗體包被于96孔微孔板中，制成固體載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中代測抗原連接于固相載體的抗體結合，然后加入生物素化的針對代測抗原的抗體，形成夾心，將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標記的親和素，再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下，轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測抗體原正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），用于樣本中待測抗原濃度測算。

1.材料與儀器

（1） 包被緩沖液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液）

（2）洗滌緩沖液 （pH 7.4，0.15 M PBS）

（3）稀釋液

（4）終止液（2 M H2SO4）

（5）底物緩沖液 （pH 5.0）

（6）四甲基聯苯胺（TMB）使用液

（7）2，2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液

（8）抗原、抗體和酶標記抗體：按說明書處理。

（9）標準品：用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。

（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶標板）。

2.步驟

⑴將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

⑵加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

⑶加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

⑷加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。